Les utilisomes de la membrane externe interviennent dans l'absorption des glycanes dans l'intestin

Nature (2023)Citer cet article

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Les bactéroïdes sont des membres abondants du microbiote humain, utilisant une myriade de glycanes dérivés de l'alimentation et de l'hôte dans l'intestin distal1. L'absorption de glycanes à travers la membrane externe bactérienne de ces bactéries est médiée par des complexes protéiques SusCD, comprenant un barillet intégré à la membrane et un couvercle de lipoprotéine, dont on pense qu'il s'ouvre et se ferme pour faciliter la liaison et le transport du substrat. Cependant, les protéines de liaison aux glycanes exposées en surface et les glycosides hydrolases jouent également un rôle essentiel dans la capture, le traitement et le transport des grandes chaînes de glycanes. Les interactions entre ces composants de la membrane externe sont mal comprises, bien qu'elles soient cruciales pour l'acquisition des nutriments par notre microbiote colique. Ici, nous montrons que pour les systèmes d'utilisation de levan et de dextrane de Bacteroides thetaiotaomicron, les composants supplémentaires de la membrane externe s'assemblent sur le transporteur central SusCD, formant des machines stables utilisant des glycanes que nous appelons utilisomes. Les structures de microscopie électronique cryogénique à une seule particule en l'absence et en présence de substrat révèlent des changements conformationnels concertés qui démontrent le mécanisme de capture du substrat et rationalisent le rôle de chaque composant dans l'utilisome.

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Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Les reconstructions Cryo-EM et les coordonnées correspondantes ont été déposées dans la banque de données de microscopie électronique et dans la PDB, respectivement : utilisome de levan sans substrat (EMD-15288 et PDB 8A9Y), utilisome de levan avec FOS DP 8–12 (EMD-15289 et PDB 8AA0), noyau SusC2D2 de l'utilisome levan avec FOS DP 8–12 (EMD-15290 et PDB 8AA1), utilisome levan inactif avec FOS DP 15–25 (EMD-15291 et PDB 8AA2), noyau SusC2D2 de l'utilisome levan inactif avec FOS DP 15–25 (EMD-1592 et PDB 8AA3), raffinement consensuel de l'utilisome dextran (EMD-15293 et PDB 8AA4). Les coordonnées et les facteurs de structure des expériences de cristallographie aux rayons X pour GHlev ont été déposés dans le PDB sous les codes d'accession 7ZNR et 7ZNS. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD034863. Les données brutes de cette étude sont disponibles au référentiel de données de l'Université de Leeds : https://doi.org/10.5518/1329. Les données sources sont fournies avec ce document.

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JBRW a été soutenu par une bourse de doctorat de 4 ans du Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). BvdB est soutenu financièrement par un prix Wellcome Trust Investigator (214222/Z/18/Z), soutenant AS et YZMF est soutenu par une bourse de l'Université de Newcastle. Nous reconnaissons la Diamond Light Source (Didcot, Royaume-Uni) pour le temps de faisceau (propositions mx306, mx1221, mx13587 et mx18598), et remercions le personnel des lignes de lumière I02, I03, I04 et I24 pour leur soutien. Tous les cryo-EM ont été effectués au laboratoire de biostructure d'Astbury, qui a été soutenu financièrement par l'Université de Leeds et le Wellcome Trust (108466/Z/15/Z et 221524/Z/20/Z). Nous remercions R. Thompson, E. Hesketh et D. Maskell pour le soutien de la microscopie électronique. La spectrométrie de masse ID des protéines a été réalisée à l'installation de spectrométrie de masse de l'Université de Leeds. Nous remercions J. Ault et R. George pour la réalisation de cette analyse. Aux fins du libre accès, les auteurs ont appliqué une licence de droit d'auteur public CC BY à toute version manuscrite acceptée par l'auteur découlant de cette soumission.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Joshua BR White, Augustinas Silale

Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Faculté des sciences biologiques, Université de Leeds, Leeds, Royaume-Uni

Joshua BR White et Neil A. Ranson

Institut des biosciences, The Medical School, Newcastle University, Newcastle upon Tyne, Royaume-Uni

Augustinas Silale, Matthew Feasey, Tiaan Heunis, Yiling Zhu, Hong Zheng, Akshada Gajbhiye, Susan Firbank, Arnaud Baslé, Matthias Trost, David N. Bolam et Bert van den Berg

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JBRW a réalisé la cryo-EM et déterminé les structures cryo-EM, supervisé par les protéines purifiées NARAS, déterminé les structures cristallines aux rayons X et réalisé l'ITC, supervisé par les protéines purifiées BvdBMF. YZ a préparé des échantillons OM pour la protéomique. TH et AG ont effectué une protéomique, supervisée par MTHZ purifié Bt1760, supervisée par DNBSF et collecté des données de cristallographie aux rayons X pour Bt1760. AB a résolu les structures cristallines du Bt1760 et a géré le laboratoire de biologie structurale de Newcastle. BvdB a généré des souches de B. theta, des protéines purifiées et du Bt1761 cristallisé. JBRW, AS, DNB, BvdB et NAR ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Bert van den Berg ou Neil A. Ranson.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Mirjam Czjzek, Stephen Withers et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

( a ) Organisation du levan PUL montrant les positions relatives des gènes au sein du PUL, avec les fonctions indiquées. Les quatre composants PUL associés à l'OM (SusClev, SusDlev, GHlev et SGBPlev) sont mis en évidence par la boîte grise. Une structure aux rayons X de GHlev (Bt1760 ; endo-lévanase GH32) est illustrée (bleu ; PDB-ID : 7ZNR). Le modèle prédit par AlphaFold2 pour SGBPlev (Bt1761) est illustré (rose) orienté de telle sorte que l'extrémité N-terminale soit en bas et que le domaine de liaison au levan proposé (C-terminal) soit en haut. Notez que les extrémités N-terminales de GHlev et SGBPlev seront lipidées et associées au feuillet externe de l'OM. La structure cryo-EM du complexe dimérique SusCDlev dans son état ouvert-ouvert est montrée (SusClev est vert, SusDlev est gris). ( b ) Organisation du dextran PUL montrant les positions des gènes dans le locus avec des fonctions marquées. Les composants PUL associés à OM sont encadrés en gris. Les modèles prédits par AlphaFold2 pour GHdex (Bt3087; GH66 endo-dextranase), le SGBPdex putatif (Bt3088) et le complexe SusCDdex, sont représentés en couleur comme pour le levan PUL en (a). ( c ) SDS-PAGE de l'échantillon précédemment étudié de SusCDlev10 purifié par LDAO avant (astérisque) et après ébullition. L'échantillon bouilli montre deux bandes faibles en plus de celles pour SusClev et SusDlev, qui ont ensuite été identifiées comme GHlev et SGBPlev par spectrométrie de masse. ( d ) Une moyenne de classe obtenue lors de la classification 3D du complexe central levan SusC2D2. Les composants SusC et SusD (vert et gris respectivement) sont ancrés dans la densité. Une grande région de densité reste non attribuée (orange). (e) Vue isolée de la densité précédemment non attribuée avec la structure cristalline de GHlev (dessin animé bleu) insérée dans la densité EM (bleu) en tant que corps rigide. La densité restante a donc été attribuée à SGBPlev et est colorée en magenta.

Données source

( a ) Sortie du premier tour de classification 3D pour les données apo utilisome. Les classes jaune, violet et rose représentent le complexe octamère, c'est-à-dire l'utilisome octamère complet. La classe verte montre les lipoprotéines supplémentaires associées à une seule unité SusC tandis que la classe bleue montre qu'une petite proportion du complexe central SusC2D2 était présente. ( b ) Sortie de la classification 3D pour l'utilisome levan avec une levanase active en présence de FOS DP8-12. Des classes (vues dans le plan de la membrane) contenant des particules du complexe octamérique complet ont été observées (bleu et vert) ainsi que des complexes hexamériques contenant une seule copie du SGBPlev et du GHlev (rose et jaune). Une classe contenant SusCDlev isolément est également présente (violet). ( c ) Résultats de la classification 3D pour les FOS longs (DP15-25) montrant que SGBPlev peut adopter une conformation «ancrée» proximale à la fois à la SusD et à la levanase. (d) Un affinement consensuel de toutes les classes contenant au moins un SGBP amarré (jaune, rose, cyan et vert dans le panneau (c)). Un masque a été créé autour de la région d'intérêt (jaune transparent). (e) Sorties de la classification focalisée sur la région masquée sans alignement. Une classe affichant une haute résolution pour la région d'intérêt est marquée d'un astérisque rouge. Des demi-cartes indépendantes ont été reconstruites à l'aide de particules non masquées appartenant à cette classe. ( f ) Reconstruction affinée générée avec les demi-cartes susmentionnées montrant une densité améliorée pour SGBPlev.

( a ) Classification 3D de l'utilisome d'apo levan vu de l'extérieur de la cellule. SusClev (vert), SusDlev (gris), SGBPlev (magenta) et GHlev (bleu). Les classes sont séparées sur leurs positions de couvercle SusDlev. États ouverts large-large (WW), normal-large (NW) et normal-normal (NN) (de gauche à droite) (b) Superposition des états ouverts large (SusD gris) et normal (SusD orange) du complexe. ( c ) Superposition de modèles atomiques pour l'état normal par rapport à l'état ouvert généré par un ajustement de corps rigide de SusDlev dans la densité cryoEM. Un monomère est indiqué pour plus de clarté et un astérisque marque la même hélice SusDlev dans les deux modèles. ( d ) Une vue des utilisomes montrés à seuil élevé dans le plan de la membrane (à gauche). Différentes conformations du SGBPlev observées dans la classification 3D sont superposées pour démontrer la flexibilité de cette sous-unité (région en boîte). La même vue tournée à 90° est représentée (à droite). La densité de micelles désordonnées est représentée en gris translucide. ( e ) Variabilité de la position de SGBPlev dans les utilisomes liés au substrat avec un FOS court (~ DP8-12) et un GHlev actif et un FOS long (DP15-25) avec un GHlev inactif. Un nouvel état est observé de manière unique dans la longue structure FOS avec un SGBPlev (orange) atteignant et contactant le SGBPlev associé à l'autre sous-unité SusC qui est présente dans un état ancré. Cette conformation est cohérente avec les deux sous-unités SGBPlev dans l'utilisome interagissant avec la même chaîne de substrat.

a, Arrangement de GHlev et SGBPlev sur SusC dans l'utilisome levan. GHlev établit des contacts avec la boucle extracellulaire 1 (or) et la boucle extracellulaire 9 (rouge), tandis que SGBPlev n'établit des contacts qu'avec la boucle extracellulaire 1. b, Arrangement de GHdex et SGBPdex sur SusC dans l'utilisome dextran. Ici, la boucle extracellulaire 1 de SusCdex est le principal site d'interaction pour GHdex, tandis que la boucle extracellulaire 9 comprend l'interface avec SGBPdex. Pour plus de clarté, une moitié de l'utilisome est représentée dans chaque cas, et les composants SusD sont omis. Notez que le modèle d'utilisome dextran est un composite de structures cryo-EM (SusCdex) et de modèles prédits d'AlphaFold2 (GHdex et SGBPdex).

Vue latérale (a) et supérieure (b) de la carte d'utilisome de dextran heptamérique. Les vues latérales (c) et supérieures (d) identiques d'un modèle atomique composite pour l'utilisome de dextran sont présentées. Les données CryoEM ont permis d'affiner le SusCdex. Les prédictions de structure AlphaFold2 pour SusDdex et GHdex ont été ancrées dans la carte cryoEM pour le complexe heptamérique. Une prédiction de structure AlphaFold2 pour une partie de SGBPdex a également été adaptée à la carte cryoEM. Une densité non ambiguë n'était visible que pour les deux premiers domaines de SGBPdex, et le modèle prédit était tronqué avant le domaine C-terminal. SusCdex = violet, SusDdex = rose, GHdex = cyan et SGBPdex = vert. Le raffinement pour le complexe heptamérique avait une résolution globale de 3,1 Å. (e) Sorties raffinées de la classification 3D visualisées où chaque carte correspond à un complément ou à un agencement unique de composants auxiliaires (comme étiqueté). ( f ) Schéma de l'architecture de deux utilisomes d'apo glycane. L'utilisome levan (à gauche) est coloré comme dans le texte principal (SusClev = vert, SusDlev = gris, GHlev = bleu et SGBPlev = magenta). Le schéma équivalent pour l'utilisome de dextran sans substrat est sur la droite. Notez la disposition différente des composants GH et SGBP par rapport à SusD dans les systèmes levan et dextran.

( a ) Densité de FOS isolée obtenue à partir de l'ensemble de données d'utilisome de levan avec GHlev actif et FOS court (DP8-12) 12. La densité du substrat (jaune) est indiquée aux seuils haut (gauche) et bas (droite). ( b ) Densité de FOS isolée obtenue à partir de la structure utilisome avec GHlev inactif et FOS long (DP15-25). La densité de levan (orange) est indiquée aux seuils haut (gauche) et bas (droite). Les flèches indiquent les branches de fructose manquantes par rapport à (a). Au site FOS1, la densité pour la décoration putative β2,1 sur Frc4 est manquante. Inversement, la densité contiguë s'étend au-delà de la densité précédemment résolue à FOS2, avec une nouvelle décoration β2,1 sur Frc5. Le substrat lié au site FOS2 suit une tendance similaire, la chaîne latérale de fructose liée β2,1 précédemment modélisée étant beaucoup plus faible avec un FOS plus long, tandis qu'une densité supplémentaire attribuée à un autre monomère lié β2,6 étend la chaîne vers le site FOS1. À des niveaux de seuil plus élevés, la densité relie les sites de liaison FOS1 et FOS2, indiquant que des FOS plus longs (~ DP15) peuvent occuper les deux sites simultanément. La densité de connexion est faible et indique des conformations multiples, compatibles avec l'absence de tout contact de SusClev à ce segment. Ces données confirment que le transporteur a une promiscuité de liaison au substrat considérable et que, comme suggéré précédemment, des FOS relativement longs (~ 15 DP) peuvent être pris en charge12. Les modèles FOS présentés proviennent de la structure cristalline originale des rayons X du complexe SusCDlev déterminée en présence de FOS courts (DP6-12)12. ( c ) Structure Cryo-EM du GHlev inactif avec FOS lié (bleu) superposé aux deux structures cristallines (7ZNR et 7ZNS; orange, gris). ( d, e ) Comparaison des FOS liés dans les sites de liaison FOS3 (le site actif) et FOS4 (secondaire) de GHlev. Les pointes de flèche indiquent des ruptures de la chaîne FOS dans les structures cristallines, peut-être en raison de l'utilisation d'un FOS DP inférieur pour la co-cristallisation que pour la cryo-EM. Les vues en (d) et (e) sont générées à partir d'une superposition.

( a ) Le titrage de 1 mM de FOS de longueur définie dans 50 μM de SGBPlev de type sauvage suggère qu'environ 15 unités de fructose sont nécessaires pour une affinité totale, qui est abolie par la mutation WAWA (W297A / W359A). ( b ) Les titrages ITC de 8 mg / ml de levan, d'inuline ou de dextrane 500 dans 50 μM de SGBPlev montrent sa spécificité pour le levan. ( c ) Données ITC des titrages de variants de GHlev (tous indiquaient des résidus mutés en alanine dans le fond inactif de D42A GHlev). Levan (8 mg/ml) a été titré dans 50 μM du variant GHlev indiqué. Les hypothèses d'ajustement des données sont décrites dans les méthodes. ( d ) Représentation de surface du modèle GHlev, avec FOS représenté par des bâtons jaunes. En médaillon, des vues agrandies des sites de liaison FOS3 (site actif) et FOS4 (secondaire), dans lesquelles des modèles atomiques en représentation de dessin animé pour FOS3 sont présentés avec des chaînes latérales pour les résidus aromatiques (Y70A, W318A). Pour le site de liaison secondaire, ces résidus sont W217A, F243A, Y437A.

Données source

a, vue d'ensemble et b, vue rapprochée du site de liaison SGBPlev FOS. Les résidus aromatiques et polaires qui interagissent probablement avec le FOS sont présentés sous forme de modèles de bâton gris. La structure cryo-EM de SGBPlev était alignée sur des modèles prédits par AlphaFold2 homologues sélectionnés ( c – f ). c, Bacteroides sp. D2 SGBPlev (UniProt E5CCB3). d, Prevotella oralis ATCC 33269 SGBPlev (E7RM14). e, Flavobacterium commune SGBPlev (A0A1D9P8I4). F, F. cellulosilyticum SGBPlev (A0A4R5CJN9). Les résidus de liaison FOS équivalents à ceux de b sont représentés sous forme de modèles de bâton gris (le cas échéant). La chaîne FOS du modèle SGBPlev cryo-EM est indiquée en b – f pour référence (orange et rouge). L'identité indiquée dans chaque panneau correspond uniquement à la séquence du domaine de liaison au levan C-terminal par rapport à SGBPlev de B. theta. Bien que nous n'ayons pas pu identifier avec certitude quels résidus SGBPlev forment des liaisons hydrogène avec FOS à partir des cartes cryo-EM, l'analyse de la conservation du site de liaison indique que N295, T350, Q352 et N384 de SGBPlev sont probablement impliqués dans la liaison FOS. L'alignement des séquences d'acides aminés des modèles présentés ici peut être trouvé dans la Fig. 3 supplémentaire.

Ce fichier contient une discussion supplémentaire, Figs. 1–4 et Références.

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Réimpressions et autorisations

White, JBR, Silale, A., Feasey, M. et al. Les utilisomes de la membrane externe interviennent dans l'absorption des glycanes dans les bactérioïdes intestinaux. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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Reçu : 08 juillet 2022

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-06146-w

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